分子克隆技术论文
克隆这个词出现于20世纪初，其含义指由单个祖先个体经过无性繁殖而产生的其他个体。下面小编整理了分子克隆技术论文，欢迎阅读!
分子克隆技术论文篇一
水稻粒型基因克隆与分子育种研究进展
摘要：水稻(Oryza sativa L.)粒型包括粒长、粒宽和长宽比，既是水稻外观品质之一，又通过影响粒重而影响产量，因此改良水稻粒型具有十分重要的意义。随着功能基因组和分子标记技术的发展，越来越多的粒型基因被克隆，部分已经开始应用于育种实践。综述了水稻粒型基因的克隆、粒型基因之间的相互关系及其在分子育种中的应用。以期为水稻育种提高产量和改良品质提供理论依据。
关键词：水稻(Oryza sativa L.);粒型;基因克隆;分子育种
中图分类号：S511;Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2014)13-2977-04
Cloning and Molecular Breeding of Grain Shape Genes of Rice
QIU Xian-jin1，YUAN Zhi-hua1，HE Wen-jing1，LIU Huan1，XU Jian-long1，2，XING Dan-ying1
(1. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China;
2. Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Beijing 100081， China)
Abstract： Rice(Oryza sativa L.) grain shape including grain length， grain width， and length to width ratio is an important appearance quality and a factor affecting rice grain weight. With the development of functional genomics and moleculars markers in last decades， a number of grain shape genes have been cloned and used in molecular breeding of rice. This paper reviews the cloning of grain shape genes， the relationship amang these genes， and their applications in molecular breeding of rice. It will provide useful information for improving yield and quality of rice.
Key words： rice(Oryza sativa L.); grain shape; gene cloning; molecular breeding
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是我国2/3以上人口的主食[1]。随着我国人口的不断增长和耕地面积的逐渐减小，粮食安全日益受到人们的重视[2，3]。从20世纪50年代开始，矮化育种和杂种优势利用使我国水稻单产大幅增长[4，5]。但是近20年来，我国水稻产量徘徊不前，迫切需要新的育种方法和技术来提高水稻产量[6]。水稻三因子中，粒重受环境影响最小，增加粒重对提高水稻单产具有十分重要的意义。
另外，随着我国人民生活水平的不断提高，人们对水稻品质的要求也越来越高。如何将提高产量和改良品质有机地结合起来是育种家们要解决的重大课题。
粒型包括粒长、粒宽和长宽比，是水稻重要的外观品质，同时也通过影响粒重对水稻产量有很大影响[7]。此外，粒型与外观品质、加工品质、蒸煮食味品质也有十分密切的关系[8]。因此克隆水稻粒型基因，开发相应的分子标记，通过分子育种改良水稻粒型，可以同时提高水稻产量和改良水稻品质。本文从水稻粒型基因的克隆、粒型基因之间的相互关系和在分子育种中的应用等方面，综述了前人在粒型性状遗传与育种方面的研究成果，以期为水稻育种提高产量和改良品质提供参考依据。
1 水稻中已克隆的粒型基因
水稻粒型基因克隆有利于人们了解粒型性状的发育过程和分子机制，帮助育种家进行育种改良。随着功能基因组学和分子标记技术的发展，近年来研究者们用遗传群体和突变体的方法克隆了许多粒型基因。
GS3是第一个克隆的粒型基因，它主要影响粒长、长宽比和粒重。Wan等[9]利用Asominori/IR24构建的重组自交系将其定位到87.5 kb区间，后来Fan等[10]利用川7/明恢63构建的回交群体将它精细定位于7.9 kb区间。GS3含有5个外显子和4个内含子，编码一个含有3个结构域的跨膜蛋白，其中OSR结构域是粒长变短的必需结构域，而VWFC结构域在水稻生长发育过程中对OSR结构域起抑制作用[11]。GS3第二个外显子上的一个C突变成A是导致短粒变成长粒的根本原因，此外还有两个SSR位点对粒长有影响[10-12]。GS3进化起源于粳稻，在进化历程中渗透到籼稻中[13]。在漫长的驯化过程中，GS3受到了强烈的正向选择。
GW2是第一个克隆的影响粒宽和粒重的主效基因，含有8个外显子和7个内含子，编码一个具有E3泛素连接酶活性的蛋白[14]。GW2在水稻中组成型表达，2个亲本的表达量没有差异，揭示2种等位基因对粒宽影响的差异不是表达量的高低，而是翻译蛋白功能的丧失，这与GS3很类似。窄粒等位基因由于一个点突变造成提前终止，编码的蛋白失去功能，细胞数目增加，灌浆速度加快，最终导致谷粒变宽。WY3(研究所用窄粒亲本)等位基因是一种稀有等位基因，在中国的核心种质中含有这种等位基因的水稻品种很少[15]。 qSW5/GW5也是一个影响粒宽和粒重的主效基因，它通过影响颖壳细胞数目影响粒宽[16]。qSW5含有一个功能位点(Functional nucleotide polymorphisms，FNP)，日本晴的等位基因有1 212 bp的缺失。关联分析结果表明，这段缺失与粒宽存在高度关联，且在驯化过程中受到了选择。qSW5/GW5编码一个含有144个氨基酸的蛋白质，具有核定位信号和一个富含精氨酸的结构域，亚细胞定位显示qSW5/GW5定位于细胞核内。qSW5/GW5可以与泛素互作，通过参与蛋白质降解途径来影响粒宽[17]。qSW5/GW5负调控粒宽。
GS5也是一个影响粒宽和粒重的主效基因，编码一个含有480个氨基酸的丝氨酸缩肽酶。关联分析显示该基因的启动子区与粒宽有关联，转基因验证也表明GS5通过表达量的变化来控制粒宽[18]。GS5正调控CDKA1、CAK1、CAK1A、CYCT1和H1这5个基因，在细胞周期中起到起始细胞分裂的作用，通过影响颖壳细胞数目来影响粒宽。与qSW5/GS5不同的是，GS5正调控粒宽。
与GS5相似，GW8也正调控粒宽和粒重[19]。GW8是OsSPL16，含有3个外显子和2个内含子，影响粒宽的功能区域也是启动子区而非编码区。GW8在组织的发育过程中表达，尤其是在7 cm穗部表达量最高。GW8通过调控细胞周期基因CDKA1、CYCD3和E2F2的表达来影响颖壳细胞数目，最终影响粒宽。在核心种质中对该基因测序发现，窄粒等位基因比宽粒等位基因品质好，因此通过GW8的选择可以同时降低粒宽和改良外观品质。
GIF1编码一个细胞壁蔗糖转化酶，该基因突变使垩白增加，粒宽变宽[20]。FLO2含有一个三角形四肽结构域，可能介导蛋白质互作[21]。FLO2突变导致粒长变短，粒宽变窄。SRS3含有12个外显子和11个内含子，编码蛋白激酶13亚家族的一个蛋白[22]。这个基因突变导致粒型变得短圆，粒重下降。DEP2/EP2/SRS1编码一个功能未知的植物特有蛋白，主要在幼嫩组织中表达，且在幼穗中表达量最高[23-25]。该基因主要影响穗轴及一次和二次枝梗的伸长，不影响穗原基的发生，并通过影响颖壳细胞形状而非细胞数目而最终影响粒型。该基因突变后，穗部直立，粒型变得短圆。SRS5基因编码α微管蛋白，在水稻中为组成型表达，但是在幼穗中表达量最高，并随着幼穗的发育其表达量上升，通过影响颖壳细胞的长度来影响粒型[26]。EP3编码一个含515个氨基酸组成的F结构域蛋白突变后导致穗长、分蘖数、每穗颖花数、育性、长宽比减小，但增加了最小维管束的数量和穗轴的厚度[27]。PGL1和PGL2都编码bHLH蛋白，都是通过抑制ANTAGONIST OF PGL1(APG)的表达发挥作用，而APG基因是水稻粒型的负调控因子。超表达这两个基因后，颖壳细胞长度增加，粒长和粒重增加[28，29]。
2 粒型基因之间的关系
目前已经克隆了一些粒型基因，它们的克隆为分子标记辅助选择提高水稻产量和改良品质提供了非常大的帮助。但是，由于上位性作用，聚合这些基因的结果很难预测。因此，除了克隆粒型新基因，了解粒型基因的分子机理外，还需要弄清楚哪种等位基因最有利，以及各个基因之间的相互关系。
Yan等[30]分别构建GS3 RNAi转基因材料、GW2 RNAi转基因材料和以Habataki为供体，Sasanishiki为受体的qSW5的染色体片段代换系三套遗传材料，用来验证这3个基因的功能，同时探究它们之间的相互关系。结果表明，在调控路径上GW2位于qSW5基因的上游，同时和qSW5一起正调控GS3，GIF1受GS3和GW2负调控以及qSW5正调控，且GS3和qSW5不同等位基因之间的效应会相互掩盖。该研究较系统地描述了粒型主效基因之间的相互关系，为后续分子标记辅助选择聚合粒型基因提高产量和改良品质提供了理论基础。
3 粒型基因在分子育种中的应用
目前，水稻中克隆的粒型基因越来越多，为育种家提供了丰富的基因资源。其中GS3、GW5/qSW5、GS5和GW8被证实在水稻驯化历程中受到了严格的选择与淘汰。在水稻常规育种中已经广泛地使用了这些基因，目前很多育成品种的粒型都得到了很大的改良。但是，这种育种方法没有针对性，延长了育种年限，降低了育种家选出优良品种的几率。因此，在水稻育种中，开发这些基因的功能标记，针对这些基因进行分子育种，将会加快育种进度，便于育种家更快速有效地选择到理想的品种。
Fan等[31]针对GS3的功能位点(C/A)设计了一个CAPs标记，并用该标记分析了180份核心种质，该标记能很好地区分GS3的两种等位基因。Ramkumar等[32]也针对该位点设计了一个基于PCR的引物。该标记极大地降低了成本，可以用于较大规模地筛选目标基因。Wang等[12]又在GS3的第四个外显子和第五个内含子处发现了2个与粒长相关的位点，并针对这2个位点设计了相应的标记。Yan等[33]根据GW2基因中1 bp的缺失设计了一个dCAPs标记，研究者也根据GW5/qSW5基因的1.2 kb缺失开发了功能标记[16，17，30]。这些标记的开发，都为分子育种选择粒型提供了标记的基础。
杨梯丰等[34]用以华粳籼74为受体、IR64为供体的单片段代换系，分析了GS3在单片段代换系下的遗传效应及与其他几个千粒重、粒宽、香味和抽穗期基因的聚合效应。结果表明，IR64的GS3导入到华粳籼74后，无论是单片段代换系还是聚合材料，粒长均增加，说明来源于IR64的GS3能够表现出增加粒长的效应。同时，其他几个基因不会对GS3产生上位性效应，GS3的基因效应在代换系和聚合材料中都能稳定表达。
张剑霞[35]用分子标记辅助选择的方法将长粒型等位基因的GS3和Xa23聚合到珍汕97B中，使粒长由原来的8.0 mm增长到9.81 mm，改良的效果十分明显。Wang等[36，37]分别将93-11的GS3和qHD8、qGHD7、qHD6.1、Wx和一个控制叶形的QTL(qFL1)导入到珍汕97B中，并进行基因聚合来改良珍汕97B的农艺性状。结果表明，改良后的珍汕97B粒长由原来的8.3 mm增加到9.2 mm，粒宽由原来的3.2 mm减小到2.9 mm，千粒重由原来的25.2 g增加到27.2 g。Wang等[19]将窄粒型等位基因的GW8与长粒型等位基因的GS3聚合到HJX74中，结果粒长增长，粒宽减小，产量基本不变，培育出了一个新品种Huabiao1。 4 展望
我国水稻育种经历了绿色革命和杂种优势利用这两个大的革新，水稻单产有了非常大的提高。但是随着人口的增长，水稻产量还需要进一步提高。同时，随着人们生活水平的提高，稻米品质越来越受到人们的重视。为了在提高单产的同时能改良水稻品质，水稻粒型的改良是最直接简单的方法。随着功能基因组和分子标记技术的发展，研究者们克隆了越来越多的粒型基因，未来将会有更多粒型基因得到克隆，它们的分子机理也会得到进一步阐明。
目前水稻粒型分子育种中只有GS3得到了广泛应用，大部分粒型基因的利用目前仅限于传统育种，主要原因是针对这些基因的功能标记技术还有待开发，或者是开发出来的功能标记技术使用成本较高。相信在不久的将来，研究者们会开发出更多更好的功能标记技术，粒型育种将会更加快速简便。
另外，随着越来越多粒型基因的定位与克隆，人们面临的另一个问题是如何更加有效地选择和利用这些基因。弄清粒型基因之间的相互关系，粒型基因对其他性状的影响也是一个很重要的议题。搞清楚这些基因的关系，从中选择最优良的基因进行粒型育种，也能极大地缩短育种进程，增加选育出优良品种的几率，提高育种效率。
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