克隆技术论文3000字
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克隆技术论文3000字篇一
利用TAIL―PCR技术克隆南极磷虾胰蛋白酶基因
摘要：目的 研究南极磷虾胰蛋白酶基因的全序列，为低温酶的基因工程制备建立基础。方法 以南极磷虾基因组DNA为模板，利用特异性的巢式引物和随机引物，通过交错式热不对称PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR) 克隆南极磷虾胰蛋白酶基因序列，并进行序列分析。结果 测序结果表明，南极磷虾胰蛋白酶基因序列全长961bp，其中含有开放阅读框(ORF)长度为798bp，编码266个氨基酸。结论 本实验成功克隆了南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步了解该酶的结构、功能和基因工程制备奠定了基础。
关键词：南极磷虾;TAIL-PCR;胰蛋白酶;基因
胰蛋白酶是动物消化系统中主要的一种碱性蛋白水解酶，属丝氨酸蛋白酶家族，能专一性地水解肽链中赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键。南极磷虾因其独特的生活环境，体内的胰蛋白酶具低温高效性，有研究表明，南极磷虾胰蛋白酶在37℃和1～3℃时的活性分别是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。深入研究该酶对适冷性酶酶学性质的探究、蛋白质工程体系的完善具有极高的价值。目前获得南极磷虾胰蛋白酶的方法主要是组织提取，这不仅步骤繁琐而且成本高昂。本文旨在克隆南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步在工程菌中表达以大量获得南极磷虾低温酶奠定基础。
交错式热不对称PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR)是一种快速有效扩增已知DNA序列侧翼未知序列的方法[2-3]，由Liu和Whittier[4]首次报道该技术。目前许多基因的克隆都是通过这个方法获得，马春骥等[5]用TAIL-PCR成功克隆了绵羊肺炎支原体Y98株的未知基因Hsp70 (DnaK) ，张伟涛等[6]利用TAIL-PCR克隆了一种耐盐基因。
1 材料与方法
1.1材料 南极磷虾冰冻样本2012年取自南冰洋水域48.1区，限制性核酸内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Genome Walking Kit购自Takala公司，pEASY-Blunt Cloning kit、pEASY-T1 Cloning Kit购自全式金公司，TIANamp Marine Animals DNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司，DNA Engine Dyad PCR仪产自美国Bio-RAD公司，PCR引物由北京华大基因公司合成。
1.2南极磷虾基因组DNA的提取 南极磷虾为本课题组参加南极科考任务所取样品，取其尾节肌肉组织提取DNA，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行基因组DNA提取。
1.3南极磷虾胰蛋白酶基因保守片段的克隆 根据文献及GenBank中已报道同源性较高的几种甲壳动物胰蛋白酶的氨基酸序列，得到两条简并引物。上游引物：CCTTACCAGCTCAGCTTCCAG;下游引物：TGCGGTGTTAGTCATAATCC。使用上述简并引物对基因组DNA进行PCR扩增，反应体系：template DNA 200ng，primer1 10pmol，primer2 10pmol，PrimeSTAR Max Premix (2X) 25μl，Sterilized distilled water to 50μl。反应条件：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 5s，35个循环，72℃延伸5min，扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，将PCR产物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，经酶切鉴定重组质粒测序。
1.4利用TAIL-PCR获得基因5' 端序列 根据克隆得到的基因序列，利用Primer5.0软件设计3条序列特异性的巢式引物，SP1： GAGGAATGGCCTGGA
CGAAGTCATT;SP2：CTCATGTTGGATGATCTTGGACAGG;SP3： AACACAATG
TCCAGCGCAGATGGC。进行TAIL-PCR时，分别用AP1 Primer和AP2 Primer进行反应，以AP2组为例，用上述提取的基因组DNA作为模板，以AP2 Primer作为上游引物，以SP1作为下游引物，进行1st PCR反应。2st PCR 反应将1st PCR反应产物稀释1000倍，取1μl作为2st PCR 反应的模板，以AP2 Primer为上游引物，以SP2作为下游引物。3st PCR 反应将2st PCR反应产物稀释1000倍，取1μl作为3st PCR 反应的模板，以AP2 Primer为上游引物，以SP3作为下游引物。三次反应的反应体系和反应条件分别参照Genome Walking Kit试剂盒。反应完成后，取3st PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收产物与pEASY-T1 Cloning 载体连接构建重组质粒，转化至大肠杆菌Trans1-T1，采用蓝白斑筛选，重组质粒经酶切验证后测序。
1.5克隆南极磷虾胰蛋白酶基因 利用已获得的南极磷虾胰蛋白酶基因5' 端和3' 端序列设计引物，基因组DNA进行PCR扩增，反应体系及反应条件同1.3。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，将PCR产物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，经酶切鉴定重组质粒，测序。
2 结果
2.1 南极磷虾胰蛋白酶基因5' 端序列 以基因组DNA为模板，利用引物SP1、SP2、SP3与Genome Walking Kit提供的随机引物AP1、AP2进行三轮PCR扩增，仅用随机引物AP2得到预期的阳性结果，电泳结果见图1。将图1第二泳道长度接近250bp的片段克隆至pEASY-T1 Cloning载体，酶切验证正确后测序得到一段长为257bp的序列，经分析，确定这257bp含胰蛋白酶5' 端及上游28bp的序列。 2.2南极磷虾胰蛋白酶基因序列分析 以基因组DNA为模板，利用基因5' 和3' 端引物进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖电泳，电泳结果见图2。将图2所得的PCR产物回收后，克隆至pEASY-Blunt Cloning载体，经酶切验证后，测序，测得其为一961bp的序列，用"GT-AG法则"[7]分析发现该片段第267-429位置是内含子，长度为163bp;同时具有两个完整的外显子区1-266和430-961。利用DNATools软件进行分析后，推断胰蛋白酶含有266个氨基酸。经Clustal X软件和NCBI Genebank软件将推测得到的氨基酸序列与已报道的胰蛋白酶氨基酸序列进行比对，发现有较高的相似度。其与凡纳滨对虾胰蛋白酶有较高的相似度(Identities=82%)，与日本囊对虾、中国对虾的相似度都达到了81%、81%。基因ORF见图3。
3 讨论
胰蛋白酶的研究历经了粗酶提取、分离纯化、分子结构、蛋白亚型研究以及基因的研究[10]，每个阶段随着实验的推进和分析数据的增加都带来新理念的更新和研究领域的扩展，现阶段甲壳动物胰蛋白酶的研究较少。利用信号肽预测软件SingnalP推断南极磷虾胰蛋白酶的信号肽为1-14aa，前体蛋白为1-29aa。和其它甲壳动物的胰蛋白酶序列一样，南极磷虾胰蛋白酶的成熟肽的序列同样是从Ile-Val-Gly-Gly开始，含有所有丝氨酸蛋白酶中都保守的活性三联体His74、Asp125、Ser225。
本实验成功克隆了南极磷虾胰蛋白酶基因，并合理推断相应的氨基酸序列，对基因的结构研究、cDNA的获得及胰蛋白酶层面的探索具有十分积极的意义，本实验结果为下一步基因表达低温胰蛋白酶提供了基础。
参考文献：
[1] Sjodahl J， Emmer A， et al. Characterization of proteinases from Antarctic krill (Euphausia superba) [J]. Protein Expr Purif， 2002， 26(1)： 153-61.
[2]Singer T， E Burke， et al. High-throughput TAIL-PCR as a tool to identify DNA flanking insertions [J]. Methods Mol Biol， 2003， 236： 241-72.
[3]Huang H， Wang G， et al. Direct and efficient cloning of full-length genes from environmental DNA by RT-qPCR and modified TAIL-PCR [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 87(3)： 1141-1149.
[4]Warshawsky D， L Miller， et al. A rapid genomic walking technique based on ligation-mediated PCR and magnetic separation technology [J]. Biotechniques， 1994， 16(5)： 792-794， 796， 798.
[5]马春骥，李敏，等. 绵羊肺炎支原体 Y98 株未知基因 Hsp70 (DnaK) 的克隆[J]. 中国兽医学报，2011， 31(12)： 1733-1737.
[6]张伟涛，程国军，周俊初. 利用TAIL-PCR克隆耐盐基因及其分析[J]. 生物技术通报，2010， (11)： 166-170， 176.
[7]吴志强. 太平洋磷虾 (Euphausia Pacifica Hansen) 胰蛋白酶样酶酶学性质及基因片段研究[D].青岛：中国海洋大学，2007：2-164.