饲养细胞制备方法_饲养细胞制备步骤

饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件。下面是小编精心为你整理的饲养细胞制备方法，一起来看看。

饲养细胞制备方法

1、小鼠(一般选取经产母鼠)脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。

2、将小鼠浸泡于75%酒精中5—10分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于超净台无菌平皿中。

3.用无菌剪镊从后腹剪开皮肤，沿两侧剪开皮肤，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。

4.用注射器吸取6-8ml的不完全培养基注射入腹腔，注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。

5.用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液。

6.800-1000 r/min离心5-10 min，弃去上清。若腹腔血管损伤，沉淀中可见有红细胞。

7.用5mlHAT培养基悬浮细胞根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度达2×105/ml。(一般情况下一只经产母鼠可铺2-3块96孔板。)

通对巨噬细胞来说，96孔板每孔需要2×104个细胞，24孔板需105个细胞。每只小鼠课的3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板饲养细胞。

8.将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,37℃,6% CO2的培养箱培养。

单克隆抗体饲养细胞的制备

小鼠腹腔细胞含有巨噬细胞，除具有饲养作用外，还可清除死亡破碎细胞及微生物。取8～10周龄同系小鼠，断颈处死后，无菌操作腹腔内注射10～15ml完全培养液，用消毒拇指轻揉腹部数次后， 吸回腹腔液体，调整细胞浓度为1×105/ml。 一般一只小鼠腹腔液可获取细胞3～5×106，可供一次融合用。亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。此外，同系小鼠脾细胞和胸腺细胞亦可作为饲养细胞。

选择性培养 两种亲本细胞经PEG处理后，可形成多种细胞成分的混合体，包括未融合的游离亲本细胞、骨髓瘤细胞间的融合、免疫B细胞间的融合以及骨髓瘤细胞与免疫B细胞间融合的异核细胞，仅后者可形成杂交瘤，应予以筛选出来克隆培养。通常应用HAT培养液，其中含有次黄嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T。

大多数实验室在融合当天就加入HAT培养液，也可次日加入。一般在融合后7～14天内使用HAT培养液，然后改用HT培养液。融合后第2～3周进行换液，每次吸出培养孔旧液1/2换入新液，以后视克隆生长情况3～5天换液1次，连续2周。3～5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增殖，当集落>3mm或布满孔底1/2时即可取上清作抗体活性检测，同时补加新鲜HT培养液。在一次较好的融合试验中，约70～80%孔有克隆生长。所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。培养3周后即可改用普通完全培养液。