高中生物单克隆抗体实验总结

2017-02-23

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高中生物单克隆抗体实验总结

(一)动物的选择

目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广,由于所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以8~12周龄为宜。

大白鼠也可,能产生较多量的单抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上,发展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。

(二)免疫

一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。

免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单抗体的关键之一。

正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞,一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合,只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了进步得到某种杂交瘤的机会,必须加强免疫,使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。

B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人以为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后7~8天,固然是抗体产生的高峰时期,但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般以为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。

1.可溶性抗原(蛋白质) 以1mg/ml~5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为0.3ml~0.6ml,间隔3~5周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml~0.4ml,3~4天后,杀死小鼠取脾做融适用。

2.颗粒性抗原 如抗原来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0.2ml,每周2次,共免疫5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人以为最后一次免疫剂量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。

单抗技术是主要由抗原制备,免疫动物,细胞融合,筛选杂交瘤细胞,克隆化培养,单克隆抗体的大量制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统,其核心部分是细胞融合。细胞融合是单克隆抗体技术的中心环节,基本步骤是将脾细胞和骨髓瘤细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

实验原理:B淋巴细胞能够产生抗体,但在体外不能进行无限分裂;而骨髓瘤细胞可以在体外无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后,用一特殊选择培养基(HAT)阻断正常细胞或自体融合细胞的DNA合成通路,而杂交瘤细胞可利用补救通路合成DNA得以生存,且既能产生抗体,又能无限增殖,并以此生产抗体的技术。

实验方法

材料:Balb/c小鼠,SP2/0骨髓瘤细胞,50%PEG,不完全培养液,HAT培养液,75%酒精,剪刀,镊子,纱布,离心管,网筛,大小瓶 皿,直头滴管,弯头滴管,瓶塞,培养瓶盖,离心管盖,烧杯(加入37℃水),泡沫板,大头针,96孔培养板,计时器,显微镜,计数板等。

单克隆抗体技术方法:

显微镜下观察血片或骨髓片,找出异常细胞。

(1)饲养细胞的制备

1.常用Balb/c小鼠,拉颈处死,浸泡于75%酒精内,3~5min。

2.用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜,剪一小口,用滴管注入5~6ml不完全培养液(严禁刺破肠管)。

3.反复冲洗,将冲洗液吸入15ml离心管,1000rpm5min离心,用完全培养液混悬,调整细胞密度。

(2)SP2/0骨髓瘤细胞的制备

1.选取状态良好、处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞。

2.弃去原瓶中培养上清,用不完全培养液冲洗三遍。

3.再以不完全培养液对细胞进行充分吹打,得到的细胞悬液移入15ml离心管。

4.细胞计数。

(3)脾细胞的制备

1.3天前加强免疫的小鼠,摘眼球取血后,拉颈处死,75%酒精浸泡3~5min。

2.将小鼠固定于泡沫板上,打开腹腔,取出脾脏,用不完全培养液反复冲洗。

3.在平皿中的网筛中,用镊子夹取脾脏进行反复研磨,边磨边滴加不完全培养液,直到脾细胞单个化,将细胞悬液转入15ml离心管中。

4.细胞计数。根据两种细胞计数结果,调整悬液用量,配平之后(SP2/0细胞与脾细胞数量比值在1:5~1:10之间),以1000rpm5min离心。

5.弃上清,每管加入5ml不完全培养液,吹打混匀后合并于同一15ml离心管中,再次以1000rpm5min。

6.离心,弃上清,用滴管吸净残留液体。

(4)细胞融合

1.前面步骤所得到的细胞沉淀,轻弹离心管管底,使其呈糊状。

2.在37℃水浴中,轻轻振荡,一边缓缓加入1mlPEG,边加边摇,PEG于1min内加完。

3.加完PEG之后,将悬液在37℃水浴中静置1min。

4.继续在37℃水浴中,边摇边加入不完全培养液2ml,于2min内加完。

5.慢慢加入不完全培养液,800rpm,8min。

6.弃上清,加入含1%HAT、20%FCS的培养液,轻轻混匀。

(5)在96孔细胞培养板中加入饲养细胞上清,1滴/孔;之后加入融合细胞悬液,1滴/孔。

(6)镜下观察96孔板中细胞情况,CO2孵箱中培养。

单克隆抗体技术实验结果计算:一只小鼠可获得(1~2.5)×108个脾细胞,与(2~3)×107个SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。显微镜下可见单个分散的细胞,细胞培养3~5天后即可出现小克隆,杂交瘤细胞较大,呈圆形且透明,其它细胞透光性差并逐渐死亡。

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