细胞与克隆技术论文
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细胞与克隆技术论文一：家兔克隆骨髓基质细胞的体外培养
【摘要】 目的 探讨家兔骨髓基质细胞在体外传代的培养。方法 取家兔股骨骨髓，分离骨髓基质细胞，于1640培养体系中培养，之后固定计数。结果 在2~6×106 个/cm2范围内，其接种细胞数与所形成的克隆集落(CFU-F)数呈良好线性关系。随着培养时间的延长，克隆集落也增多，变大。3周龄家兔的造血基质祖细胞较6周龄者为多。结论 基质祖细胞CFU-F呈非均质性的，可能存在不同亚群。
【关键词】 家兔;骨髓;造血基质祖细胞;克隆
作者单位：100021北京，中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所(赵伟霞);湖北省武汉疾控中心(赵丁源)
The culture of colonies of rabbit bone marrow stromal cell in vitro
ZHAO Wei-xia, ZHAO Ding-yuan. Institute for Environmental Health and Related Product Safety, Chinsese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100021,China
【Abstract】 Objective To investigate the growing variation of the culture of colonies of rabbit bone marrow stomal cell in vitro. Methods Extracted rabbit bone marrow stomal cell, then cutlured these cell isolated in 1640 cultre system of CO2incubator. Count the colony after fixed. Results There was a clearly linear relationship between the number of implanted cells and the formed colonies in a some concentration (2~6×106 /cm2),and the colonies of bone marrow stromal cell were increasing with the time extending.The CFU-F of the three weeks rabbit were more than that of the six weeks rabbit. Conclusion The CFU-F are nonhomogenous, and might be heterogeneous subgroups.
【Key words】 Rabbit; Bone marrow;Hematopoietic matrix grand mother cells; Colony
骨髓基质细胞是支持和调节造血细胞定居、增殖、分化、发育和成熟的内环境主要细胞成分[1]。曾对小鼠体外单层培养造血基质细胞的培养研究，发现其接种的细胞数与成集落数呈良好的线性关系[2]。目前对家兔的骨髓器官基质细胞的研究国内研究有过报道[3]。本文用体外培养骨髓基质细胞技术[4]对家兔的骨髓基质细胞体外培养特点进行了探讨。
1 资料与方法
1.1 材料来源 实验动物系北京科宇动物养殖中心饲养的雌雄两性、3~6周龄之纯种家兔。
1.2 主要试剂与器材 RPME1640培养液，小牛血清(中国药品生物制品检定所)，平底中性玻璃培养瓶，二氧化碳孵箱，微孔滤网。
1.3 骨髓单个核细胞制备 6周龄家兔用乙醚麻醉处死;3周龄者则用颈椎脱臼致死。在无菌条件下取双侧股骨修洁后剪掉骺端，用带16号针头注射器以1640培养液冲出骨髓细胞，再用滤网过滤制取单个核细胞悬液，计数后用所需细胞量进行体外CFU-F培养。
1.4 CFU-F培养和测定 将6周龄家兔的骨髓细胞以2×106 个/cm2, 3周龄的以2~6×106 个/cm2置于含20%小牛血清的1640培养液的培养体系的培养瓶中，于37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱内培养。分别于第4天，第6天用含20%小牛血清的1640培养液换液，培养到第八天冲洗后用甲醛固定半小时，蒸馏水冲洗后用姬姆萨染色12 min后晾干，待计数用。
2 结果
2.1 CFU-F克隆集落形成过程观察 于培养第4天在倒置显微镜下观察培养细胞，发现淡红色背景下(红细胞)有圆形发亮的较大基质细胞生长，拉长的细胞较少见，振荡后观察未见发亮细胞浮起，说明细胞已贴壁。培养第六天镜下观察，发现基质细胞明显增多，拉长者较多，形成了克隆集落，6周龄的骨髓基质细胞 生长速度明显低于3周龄者，且培养同天数的6周龄的克隆集落数明显低于3周龄的克隆集落数。
2.2 CFU-F计数 计数由50个以上细胞所形成的集落数，结果如图1、2和表1。由50~99个细胞组成的集落为小集落，由100~199个细胞组成的集落为中集落，>200个细胞者的为大集落。
3 讨论
从以上述结果可以发现：培养时间越长，形成克隆集落相对越多，3周龄者，骨髓细胞较多，造血基质祖细胞也较多，形成的克隆集落数也多。在2~6×106个/cm2范围内，形成的克隆集落数与种植细胞数呈良好的线性关系。
通过对集落大小，所含细胞数与密度比较，表明CFU-F非均质性的，可能存在不同亚群。这对体外培养骨髓细胞的增殖与分化有一定的指导意义。
参 考 文 献
[1] 姚程，彭丽萍，姜振宇,等.骨髓基质细胞体外扩增能力及支持造血的研究.白求恩医科大学学报,2001,17(4)：386-388.
[2] 于洪臣, 郭占之, 毕晓颖, 等.白求恩医科大学学报, 1991,17(3):219.
[3] 王春艳，何欣，李增新,等.兔骨髓基质细胞的分离培养研究.北华大学学报，2005,6(6)：520-522.
[4] 蔡国锋，黄开，章庆国.兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究.东南大学学报，2006，25(1)：16-19.